上海恒遠生物科技有限公司技術明確表明ELISA實驗樣本要求: 血清標本宜在新鮮時檢測,嚴重溶血標本禁用。一般說來,在5天內測定的血清標本可放置于4℃,標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合。超過一周測定的需-20℃保存。凍結血清融解后,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混勻并避免產生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾,澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存;使用一次性玻璃試管或真空管采血管;并使用非抗凝標本,肝素抗凝血漿會增加OD值,可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關;EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統中辣根過氧化物酶活性;血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清,或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑。
關于ELISA結果造成假陽性的原因我司技術做出如下原因分析:
1.樣本嚴重溶血 ,以HRP為標記的ELISA測定中,殘留在孔內的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性,催化底物顯色造成假陽性。
2. 混有紅細胞的血清沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈;如有細菌污染 ,菌體中可能含有內源性HRP,也會產生假陽性反應;
3. 標本凝固不全 ,有時為了爭取時間快速檢測,常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清,使血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結果;
4. 采血試管洗滌不* 、反復使用易交叉污染; 塑料試管能吸附抗原物質 ,樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性。